技术| ELISA样品收集处理及常见问题分析
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ELISA实验各类样品处理
通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。正确的处理样本是保证ELISA检测的正确性和准确性的第一步，下面简单介绍一下不同类型的样本的处理方法。
1. 血清
血清是最常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜，使血清析出。（最好将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃ 1000×g离心20分钟，仔细收集上清。建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色，而导致检测的不准确性。同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。
2. 血浆
用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30min内4℃ 1000×g离心15min，取上清即血浆。将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。
3. 细胞培养上清
取细胞培养上清到离心管，1000×g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
4. 细胞裂解液
1） 吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹下来；
2） 收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次；
3） 加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。通常6孔板一个孔的细胞量需要150~250μL PBS重悬；
4） 将样品放入-20℃或-80℃，使样品冷冻，再放室温解冻样品，反复冻融几次，使细胞充分裂解。也可将样品进行超声破碎，以达到裂解的目的；
5） 4℃ 10000×g 离心10min，除去细胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融；
5. 组织匀浆液
1） 将组织样本用PBS (0.01M, PH 7.4) 冲洗，洗去组织表面残留的血液或杂质；
2） 将组织块称重，记录后剪碎，碎块应尽量小，便于匀浆得更充分；
3） 将组织按一定的比例加入预冷的PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂）匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴中（通常按组织重量：PBS体积=1:9的比例匀浆，例如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数）；
4） 吸取匀浆液到离心管，4℃ 5000×g 离心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融；
6. 尿液、唾液等其他液体生物样本
1000×g离心20min，取上清即可检测。
总的来说，因为ELISA只能检测可溶性蛋白的含量，所以应保证所有样本均为澄清的液体，沉淀或悬浮物都应离心去除。为了保证检测的准确性，保存于-20℃或-80℃的样本最好在1~6个月内检测；4℃保存的样本应在1周内进行检测。另外，还应保证样本不含NaN3，因为NaN3会抑制HRP的活性，从而导致假阴性的结果。
ELISA实验常见问题
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| 如果是在双抗体夹心法中出现，有可能是包被抗体与二抗间有交叉反应 | |
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此文转载Elabscience微信公众号
